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将肿瘤坏死因子α(TNFa)抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中的肿瘤坏死因子α(TNFa)与连接于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的肿瘤坏死因子α(TNFa)抗体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子α(TNFa)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(O.D.值)，计算样品浓度。